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研究栉江珧和近江牡蛎精子超低温冷冻技术不同点

作者:1分快三平台网站 日期:2016/11/5 8:46:10 信息来源:http://www.zigbee-automation-home.com/

通过对栉江珧和近江牡蛎的精子冷冻过程中抗冻剂的种类和浓度、降温程序、精子稀释方式、保存体积、平衡时间、保存时间等方面展开了比较筛选,利用显微镜直接检测和曙红Y(eosinY)染色后检测两种方式检验精子活率,比较归纳了两种精子超低温冷冻技术的异同点,尝试建立一套适用于栉江珧和近江牡蛎等物种精子的超低温冷冻保存技术。

1材料与方法

1.1精液的采集

栉江珧和近江牡蛎除去表面附着物后洗净,于实验室暂养,选择性腺成熟饱满的栉江珧和近江牡蛎雄贝解剖精液采集见文献。取少量精液直接镜检,若精子活率达到90%以上,则将剩余精子作为研究对象。

1.2抗冻剂的筛选

用过滤消毒的海水作为基础液,选用二甲亚砜(DMSO)和甘油(glycerol,Gly)为抗冻剂,设置DMSO终浓度(V/V)和甘油终浓度(V/V)分别为6%、8%、10%、12%和14%。每组样品在进入1分快三平台网站 前先于4℃下平衡20min,样品体积为1mL,实验重复3次。保存30d后复苏检测精子活率。

1.3降温程序的筛选

设冷冻程序A、B、C和D4组。A组:在距离液氮面15cm处停留5min;B组:分别在距离液氮面15和5cm处各停留5min;C组:分别在距离液氮面15和5cm处停留5和10min;D组:不经液氮面平衡,直接浸入液氮中保存。用终浓度8%和10%DMSO作为抗冻液,4℃下平衡20min。样品体积为1mL,实验重复3次。保存30d后复苏、检测精子活率。

1.4精液稀释方式的筛选

20%的DMSO在4℃下与精液混合以稀释精液,DMSO终浓度为8%和10%。设置3种稀释方式,I1mL抗冻液一次性与1mL精液混合;Ⅱ:将抗冻液等分为2份,依次与精液混合,间隔8min;Ⅲ:将抗冻液等分为3份,依次与精液混合,每次间隔8min。整个混合过程约30min。4℃平衡20min,按降温程序C降温,样品体积为1mL,实验重复3次。保存30d后复苏检测精子活率。

1.5平衡时间的筛选

以终浓度8%和10%DMSO为抗冻液,按方式Ⅲ将精液与抗冻液混合后,设置4℃下的平衡时间,分别为0、5、10、15、20、25和30min。按照降温程序C降温,样品体积为1mL,实验重复3次。保存30d后复苏检测精子活率。

1.6保存样品体积的筛选

以终浓度8%和10%的DMSO为抗冻液,按方式Ⅲ将精液与抗冻液混合,设置0.2、0.6、1.0、1.4和1.8mL5个样品体积。4℃平衡20min,按降温程序C降温,实验重复3次。保存30天后复苏检测精子活率。

1.7不同保存时间复苏效果的比较

以终浓度8%和10%的DMSO为抗冻液,按方式Ⅲ将精液与抗冻液混合,4℃平衡20min,按降温程序C降温,样品体积为1mL,按以上程序超低温冷冻保存的一批样品,分别在冷冻0、0.5、1、7、30和180d后取出,(39±1)℃水浴解冻,统计精子活率。实验重复3次。

1.8精子活率的检测

同时用两种方法检测活率。方式I为直接镜检。将解冻后的精子置于载玻片上,滴入0.005%的氨海水刺激,在显微镜下直接观察精子活率。精子活率指视野中运动精子占总精子的比例。方式Ⅱ为曙红Y染色镜检。用过滤消毒海水配置曙红Y染色液,使终浓度为0.04%,染色15min后镜检精子活率,其中活精子,实验重复3次。

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